動物產(chǎn)生抗體的機理：抗原免疫動物→激活B細胞→轉(zhuǎn)化成漿細胞→分泌針對抗原的特異性的抗體?？贵w產(chǎn)生是從抗原刺激免疫動物產(chǎn)生強烈免疫應(yīng)答開始的，離不開高效的動物免疫，實際操作中以檢測血清中抗體效價來衡量實際免疫效果[1]。

動物免疫中的抗原

為了制備特異性強，效價高，親和力好的優(yōu)質(zhì)免疫抗體，首選必須要有合適的抗原。抗原的基本特性包括免疫原性和反應(yīng)原性。免疫原性是指某抗原能作用于T細胞、B細胞的抗原識別受體，進而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。反應(yīng)原性是指抗原與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合的特性, 此特性又稱為免疫反應(yīng)性?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇，或稱為表位，是抗原與抗體分子特異結(jié)合的區(qū)域，一個抗原分子可帶有不同的決定簇[2]。反應(yīng)原性與抗原決定簇的性質(zhì)、空間、位置、立體構(gòu)象以及種屬差異等密切相關(guān)。而免疫源性與抗原本身的多種因素相關(guān)[3-6]，包括：

1. 異源性：自體或自身抗原通常免疫原性較差，抗原與宿主生物之間的異源性越大，免疫反應(yīng)越強。

2. 分子大?。嚎乖肿恿吭降?，其免疫原性相對偏弱。例如，分子質(zhì)量大于100,000 Da的分子通常是活躍的免疫原，而小于5,000-10,000 Da的分子則免疫原性較差。

3. 化學(xué)性質(zhì)和組成：抗原主要是由蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)或核酸組成的。蛋白質(zhì)具有最強的免疫原性，其次是多糖；而脂質(zhì)與核酸一般并不能成為免疫原，常常要借由與蛋白質(zhì)結(jié)合才能激活免疫應(yīng)答反應(yīng)。一般來說，物質(zhì)的化學(xué)成分越復(fù)雜，其免疫原性就越強。

4. 降解性：易被吞噬的抗原通常更具免疫原性，這是因為對于大多數(shù)抗原（T依賴性抗原），免疫反應(yīng)的發(fā)展要求抗原被APC吞噬、處理并呈遞給輔助性T細胞。

根據(jù)抗原的免疫原性與反應(yīng)原性，抗原可分類為完全抗原與不完全抗原。完全抗原既具有免疫原性又有反應(yīng)原性[7]。不完全抗原只具有反應(yīng)原性而缺乏免疫原性, 亦稱為半抗原[8]。半抗原單獨作用于機體的免疫系統(tǒng)時無免疫原性，當與蛋白載體結(jié)合形成半抗原-載體偶聯(lián)物時，即可獲得免疫原性。例如，合成肽抗原通常太小而不能刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答，需與KLH、BSA、OVA等載體蛋白交聯(lián)后成為完全抗原才能刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。需要注意的是，這種偶聯(lián)物不但可刺激機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對半抗原的抗體，也可以刺激機體產(chǎn)生針對蛋白質(zhì)載體的抗體，因此在抗體篩選時需再偶聯(lián)另一種不同的載體蛋白進行篩選。

為了達到更好的免疫效果以獲得高質(zhì)量的抗原特異性抗體，除了抗原本身的性質(zhì)，免疫過程中的操作和免疫動物的選擇等因素也至關(guān)重要。

抗原制備和乳化

免疫用的抗原一般為溶液和凍干粉兩種形式。凍干粉加生理鹽水或PBS后放室溫30 min充分溶解，在溶液中的抗原應(yīng)使用新配制的滅菌生理鹽水或PBS稀釋。免疫佐劑是指與抗原同時或預(yù)先注射到動物體內(nèi)，可非特異性地增強機體對該抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì) ，又稱為非特異性免疫增強劑。可溶性抗原較多采用佐劑免疫法，使抗原與佐劑混合制成穩(wěn)定乳劑后用于羊駝免疫。顆粒性抗原多采用無佐劑免疫法，將顆?？乖肞BS或生理鹽水制成混懸液（1%）進行免疫。

表一：常見佐劑種類以及其優(yōu)勢和缺點。

常用的抗原乳化方法有乳缽研磨法、注射器推注法，超聲乳化法和機械攪拌法等多種[9]?？乖庖咦魟┳畛Ｓ玫氖歉ナ贤耆魟┳魟┖透ナ喜煌耆魟?，二者的主要差別在于弗氏完全佐劑含有卡介苗，主要成分為礦物油和羊毛脂，它可以增強抗原的免疫原性以及改變機體的免疫反應(yīng)性，達到增強免疫力或提高抗體產(chǎn)生水平以及使抗原在體內(nèi)維持時間明顯延長等功效。抗原的乳化程度直接影響免疫效果，因此乳化后必須進行質(zhì)量檢查?？乖c弗氏佐劑乳化后性狀形成油包水，乳化檢查的方法是：將制成的乳劑滴一滴在涼的自來水表面，質(zhì)量合格的乳劑滴入水面后應(yīng)保持乳滴珠完整不分散（見圖1）。

圖1

免疫動物的選擇

納米抗體制備的宿主動物一般選用羊駝[10-12]。動物的遺傳因素、營養(yǎng)狀況等因素直接影響到動物免疫應(yīng)答的強弱。有的動物個體甚至有先天免疫缺陷，從而導(dǎo)致免疫失敗。動物維生素及氨基酸的缺乏都會使機體的免疫功能下降。環(huán)境衛(wèi)生狀況不良，圈舍及周圍環(huán)境中存在大量病原微生物，在動物免疫期間受到病原的感染，這些都會影響免疫效果。免疫用的羊駝最好選擇2-3歲的年青成年動物，免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟。特別要注意避免使用妊娠期的雌性動物用于制備免疫抗體。

羊駝免疫前的健康狀況：體重約50--70 kg，年齡在2-3歲左右；體格發(fā)育正常，營養(yǎng)狀況及精神狀態(tài)良好，羊駝背毛光亮；運動及行為無異常，無跛行、不協(xié)調(diào)等異常的肢勢，有警覺性及反應(yīng)迅速；外部觀察無外傷，則可以進行后續(xù)的免疫實驗（見圖2）。免疫前用專用的牌子固定于羊駝的頸部，寫明羊駝的牌號，免疫前，還應(yīng)采血測定動物體內(nèi)有無滴度交叉反應(yīng)性天然抗體的存在。為確保動物在整個免疫進程中的健康狀態(tài)，需要對羊駝來源，飼養(yǎng)環(huán)境需進行控制。由于對免疫應(yīng)答的個別差異，免疫時可選用多只動物進行免疫。

圖2

免疫方案

實際操作中，免疫劑量、免疫部位以及免疫間隔時間的組合都會對免疫結(jié)果產(chǎn)生較大影響，需對免疫血清抗體效價進行監(jiān)控，根據(jù)實際的免疫效果調(diào)整。

圖3

免疫途徑：不同的免疫途徑，包括淋巴結(jié)密集區(qū)皮下注射，和靜脈注射。 一般來說，皮下途徑優(yōu)于靜脈途徑。因為靜脈注射的抗原首先進入脾臟，而皮下注射的抗原首先進入局部淋巴結(jié)。羊駝一般選用頸部淋巴節(jié)附近左右兩側(cè)進行多點注射。

免疫原劑量：免疫原的注射劑量隨抗原的性質(zhì)有較大差異。一般應(yīng)考慮抗原的免疫原性的強弱、分子量大小、抗原的純度以及動物個體的狀態(tài)、免疫途徑和免疫時間，佐劑的使用等做相應(yīng)的調(diào)整。劑量過低，不能引起足夠強的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價是隨注射劑量的增加而增高。一般而言，抗原量多，時間間隔長，劑量可適當加大。對于純的可溶性抗原，免疫時一般與等量的弗氏完全佐劑混合進行首次免疫，免疫劑量為500 μg，后續(xù)免疫劑量可以與首次劑量相同或為首次劑量的 1/2，顆粒性抗原（細胞）的免疫劑量為5*107-1*108/次。

免疫周期一般隨抗原和免疫方法的不同以及是否使用佐劑而變化，間隔時間可從數(shù)日到數(shù)周。初次免疫與加強免疫的間隔時間多為2周，免疫的總次數(shù)多為 4次，半抗原需經(jīng)長時間的免疫才能達到高效價，可增加1-2次免疫。免疫時間和周期可參考表1羊駝免疫周期表。

測定抗體效價：一般情況下，在加強免疫后7-10天即可采血（見圖4），分離血清測定抗體效價。對于免疫性質(zhì)不確定的小分子和多肽片段等半抗原，一般還應(yīng)在初免后14天采血測定效價，以確定抗原的免疫原性和動物的反應(yīng)性。抗體效價的測定方法有很多，常用的方法有ELISA和FACS。

圖4

表二：羊駝免疫周期表

圖5

本期文章引文
[1] Newmark P. Nobel prize for Japanese immunologist. Nature, 1987, 329(6140): 570.

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[8] Landsteiner, Karl. The Specificity of Serological Reactions, 2nd Edition, revised. Courier Dover Publications. 1990. ISBN 0-486-66203-9.

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[11] Beghein E, Gettemans J. Nanobody technology: a versatile toolkit for microscopic imaging, protein–protein interaction analysis, and protein function exploration[J]. Frontiers in immunology, 2017, 8: 276923.

[12] Bélanger K, Iqbal U, Tanha J, et al. Single-domain antibodies as therapeutic and imaging agents for the treatment of CNS diseases[J]. Antibodies, 2019, 8(2): 27.