摘要
2022年12月9日，香港中文大學(xué)（深圳）醫(yī)學(xué)院趙永娟團(tuán)隊(duì)及其合作者在Nature Communications（自然-通訊）雜志發(fā)表題為A conformation-specific nanobody targeting the nicotinamide mononucleotide-activated state of SARM1（一種靶向 SARM1 煙酰胺單核苷酸激活狀態(tài)的構(gòu)象特異性納米體）的研究論文。研究人員利用康體生命抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，用SARM1蛋白免疫羊駝并建立噬菌體庫(kù)，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出能夠與SARM1激活狀態(tài)構(gòu)象特異結(jié)合的納米抗體Nb-C6。SARM1的激活可導(dǎo)致細(xì)胞鈣離子水平升高，與多途徑誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)病變有關(guān)。了解 SARM1的激活機(jī)制具有重要意義，Nb-C6能夠特異結(jié)合并穩(wěn)定激活狀態(tài)的SARM1，Nb-C6幫助研究者探究了SARM1在激活過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化，并可以對(duì)細(xì)胞中的活性 SARM1 進(jìn)行成像和定位，提供了在活細(xì)胞中操縱 SARM1 的方法。

前言

正文
研究人員為了了解 SARM1激活狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，采取了利用納米抗體(Nb)穩(wěn)定SARM1活性形式結(jié)構(gòu)的方法。研究人員用重組的SARM1與弗氏佐劑混合免疫羊駝。經(jīng)過(guò)6輪免疫后，從外周淋巴細(xì)胞提取mRNA，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了納米抗體文庫(kù)（圖1），利用噬菌體展示技術(shù)篩選到了多條能與SARM1結(jié)合的陽(yáng)性克隆。其中，Nb-C6能夠特異識(shí)別 NMN 激活的 SARM1。 

圖1 Nb-C6的研發(fā)流程

研究人員用表面等離子體共振（SPR）技術(shù)測(cè)試了在不同濃度配體溶液中Nb-C6與SARM1的結(jié)合情況，在高 NAD 濃度（1.6 mM）下，Nb-C6 與 SARM1 的結(jié)合非常低。隨著配體濃度轉(zhuǎn)變至100 μM NMN，Nb-C6與 SARM1的結(jié)合比例增加到了60%以上，其線性擬合圖和結(jié)合示意圖如圖2所示，表明 NAD / NMN 比率決定了 Nb - C6與SARM1的結(jié)合，Nb-C6能夠特異結(jié)合NMN激活狀態(tài)下的SARM1。

                                                                                                                  圖2 Nb-C6指示并促進(jìn)SARM1的激活

研究人員進(jìn)一步測(cè)試了與mNeonGreen (mNG，一種熒光標(biāo)記蛋白)融合表達(dá)的Nb-C6可視化檢測(cè)細(xì)胞中激活形式的SARM1的能力。表達(dá)了SARM1 的HEK 293 細(xì)胞用CZ-48（能夠穿透細(xì)胞膜的NMN類(lèi)似物）處理，成像結(jié)果表明，Nb-C6的結(jié)合在 CZ-48 激活 SARM1 后顯著增加，證實(shí)了其構(gòu)象特異性并表明線粒體定位的 SARM1 的激活經(jīng)歷了構(gòu)象變化。此外，作者還發(fā)現(xiàn)Nb-C6單獨(dú)在體外可以激活SARM1，但與NMN和兩者一起激活相比效果明顯較弱。他們還證明，在內(nèi)源表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)SARM1的兩種HEK 293細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)Nb-C6（C6-YFP）導(dǎo)致cADPR水平升高，表明內(nèi)源性和誘導(dǎo)性SARM1分別被激活。在過(guò)度表達(dá)不相關(guān)Nb的對(duì)照細(xì)胞中沒(méi)有觀察到cADPR的增加。上述結(jié)果充分驗(yàn)證了 Nb-C6 僅識(shí)別 SARM1 的激活形式，最低限度地識(shí)別非活性形式，表明 Nb-C6 是激活活細(xì)胞內(nèi)源性和外源性 SARM1 的有價(jià)值的工具。

圖3 (a) Nb-C6 對(duì) CZ-48 激活的 SARM1 進(jìn)行染色，表達(dá)SARM1的 HEK293 細(xì)胞用 1 μg/mL 多西環(huán)素處理 12 小時(shí)，然后用 100 μM CZ-48 處理 6 小時(shí)，固定細(xì)胞并分別用 C6-mNeonGreen、抗 SARM1多克隆抗體、線粒體染料Tom20染色。水平比例尺：5 μm；（b）Nb-C6 染色和抗 SARM1 染色信號(hào)的比率。

為深入了解SARM1的激活機(jī)制，研究人員通過(guò)冷凍電子顯微鏡獲得了SARM1NMN/Nb-C6 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（分別率：2.7 ?），復(fù)合物含兩層八聚環(huán)，包含16個(gè)SARM1和16個(gè)Nb-C6。Nb-C6 主要與 SAM 結(jié)構(gòu)域結(jié)合并在 C 末端二聚化，穩(wěn)定整個(gè)結(jié)構(gòu)。SARM1NMN 的整體結(jié)構(gòu)呈“盛開(kāi)的蓮花”形狀（圖 3a-c），與 SARM1NAD 緊湊的“甜甜圈”結(jié)構(gòu)（圖4）形成鮮明對(duì)比。 相較于SARM1NAD， ARM-TIR 域作為一個(gè)整體從 SAM 域擺動(dòng)并旋轉(zhuǎn)~139°。NMN 結(jié)合暴露區(qū)域后，SARM1 的這種大構(gòu)象變化被 Nb-C6 識(shí)別，說(shuō)明其僅對(duì) NMN 激活的 SARM1 具有特異性。

圖4活化和非活化狀態(tài)下 SARM1 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。a–c SARM1NMN/Nb-C6 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，（a）頂視圖； (b) 底視圖；(c) 側(cè)視圖; SARM1 和 Nb-C6 顯示為表面模型，ARM 域?yàn)榫G色，TIR 域?yàn)槠芳t色，SAM 域?yàn)辄S色，Nb-C6 為灰色，NMN 顯示為紅色球體。d-f SARM1NAD (PDB 7ANW) 的整體結(jié)構(gòu)。 （d） 頂視圖； （e） 底視圖； （f） 側(cè)視圖；SARM1 顯示為表面模型，ARM 域?yàn)樗{(lán)色，TIR 域?yàn)樾←溕?，SAM 域?yàn)辄S色，NAD 顯示為紅色的球體模型。(g) NMN 和 NAD 結(jié)合的 SARM1 疊加的側(cè)視圖。為清楚起見(jiàn)，只有一個(gè) NMN 結(jié)合和 NAD 結(jié)合形式的SARM1顯示為卡通模型，其他結(jié)構(gòu)被淡化，SARM1NMN 復(fù)合物中的 Nb-C6 被隱藏。SARM1NMN 的顏色與圖(a–c) 中一樣，SARM1NAD 的顏色與圖 (d–f) 中一樣；ARM 域中的殘基 E60 和 Q81 以及 TIR 域中的 E686 顯示為球體；相應(yīng)殘基的重新定向由黑色箭頭指示。

研究人員通過(guò)分析結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，深入的解析了NMN誘導(dǎo)的SARM1激活機(jī)制，發(fā)現(xiàn)NMN 結(jié)合位點(diǎn)與 NAD 的結(jié)合位點(diǎn)相同，并通過(guò)ARMNMN 和 ARMNAD 之間的結(jié)構(gòu)差異解釋了為何NMN 是激活劑而 NAD 是抑制劑。NMN/NAD 結(jié)合位點(diǎn)處的突變可以消除神經(jīng)元中SARM1對(duì)煙酰胺核糖誘導(dǎo)的NMN 積累的反應(yīng)。作者還發(fā)現(xiàn)ARM 域的向內(nèi)彎曲對(duì)于 NMN 誘導(dǎo)的 SARM1 激活是必要的。接下來(lái)，作者研究了 NMN 誘導(dǎo)的 ARM 彎曲如何導(dǎo)致其從 SAM 域解離，并發(fā)現(xiàn)納米抗體主要與 SAM 域結(jié)合，較小程度上與 ARM-SAM 連接子結(jié)合。Nb-C6 和 SAM 域之間的結(jié)合界面在很大程度上與ARM:SAM 界面重疊（圖 5），這說(shuō)明 Nb-C6 無(wú)法識(shí)別非活性 SARM1，因?yàn)榻Y(jié)合位點(diǎn)被 ARM 遮蓋了。

HDX-MS （氫氘交換質(zhì)譜）和 XL-MS（交聯(lián)質(zhì)譜） 數(shù)據(jù)表明 NMN 激活的 SARM1 在溶液中經(jīng)歷了一系列 ARM 和 TIR 結(jié)構(gòu)域重排。因此，Nb-C6 穩(wěn)定結(jié)構(gòu)可能代表這種最終激活狀態(tài)的中間體。如圖 6 所示，在這個(gè)最終狀態(tài)下，TIR 域從 ARM 脫離并直接與相鄰的 TIR 相互作用，形成多聚體并導(dǎo)致酶促活動(dòng)。這種構(gòu)象變化與 ARM 結(jié)構(gòu)域重排相結(jié)合，有助于 SARM1 外圍環(huán)的分解。

                                                                                     圖6 SARM1在非激活和激活狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換模型

小結(jié)
SARM1 因其在軸突退變（AxD）中的作用而受到關(guān)注。SARM1 是 NADase 和自我調(diào)節(jié)信號(hào)酶，可生成 cADPR 和 NAADP。SARM1 的激活是由細(xì)胞內(nèi) NAD 的減少引起的，可在諸如紫杉醇誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)病變情況下發(fā)生； NMN也可激活 SARM1。研究人員發(fā)現(xiàn)了一種構(gòu)象特異性納米抗體Nb-C6，通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)證明了Nb-C6僅穩(wěn)定并結(jié)合激活狀態(tài)的 SARM1，并利用Nb-C6實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中激活狀態(tài)的SARM1的成像與定位。Nb-C6幫助作者獲得了SARM1在激活狀態(tài)的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，聯(lián)合HDX-MS 和 XL-MS 方法，深入解析了SARM1的激活機(jī)制。納米抗體相較于傳統(tǒng)抗體有更優(yōu)秀的理化性質(zhì)，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有諸多應(yīng)用。 康體生命提供一站式納米抗體發(fā)現(xiàn)服務(wù)，歡迎咨詢(xún)與交流！